怎么使用rmats進(jìn)行可變剪切的分析

本篇文章給大家分享的是有關(guān)怎么使用rmats進(jìn)行可變剪切的分析，小編覺得挺實用的，因此分享給大家學(xué)習(xí)，希望大家閱讀完這篇文章后可以有所收獲，話不多說，跟著小編一起來看看吧。

rmats是目前使用的最廣泛的可變剪切分析軟件，該軟件不僅可以識別可變剪切事件，還提供了定量和組間差異分析的功能，功能強大。該軟件前后經(jīng)歷了多個版本，目前最新版本為v4.0.2, 相比之前的版本，v4.0之后的版本在運行速度，內(nèi)存消耗，磁盤占用等方面進(jìn)行了優(yōu)化，最明顯的就是運行速度，比之前快了100多倍。

安裝也很簡單，直接下載解壓縮即可使用，這里不贅述。rmats可以識別以下五種類型的可變剪切事件

軟件的基本用法如下

python rmats.py  \
--b1 b1.txt --b2 b2.txt \
--gtf ref.transcript.gtf \
--od out_dir \
-t paired \
--readLength 101 \
--cstat 0.1 \
--libType fr-unstranded

b1.txt中保存的是每個樣本比對參考基因組的bam文件的路徑，示例如下

/bams/rep1.bam,/bams/rep2.bam

這種用法從bam文件開始，實用性更強，除此之外，也支持從fastq文件開始，用法如下

python rmats.py \
--s1 s1.txt --s2 s2.txt \
--gtf ref.transcript.gtf \
--bi /STARindex/hg19 \
--od out_dir \
-t paired \
--nthread 6 \
--readLength 151

S1.txt中保存的是每個樣本fastq文件的路徑，rmats會自動調(diào)用STAR進(jìn)行比對，bi參數(shù)指定參考基因組STAR的索引，更多參數(shù)和細(xì)節(jié)請參考官方文檔。

rmats中核心功能就是定量和差異分析，解釋如下

1. 定量

rmats采用exon inclusion level 來定義樣本中可變剪切事件的表達(dá)量，以外顯子跳躍為例，正常的isoform稱之為Exon Inclusion Isofrom, 發(fā)生了外顯子跳躍的轉(zhuǎn)錄本稱之為Exon Skipping Isofrom, 示意如下

比對到inclusion  isoform上的reads用I表示，比對到skipping isoform上的reads用S表示, 則該外顯子跳躍的可變剪切事件的表達(dá)量如下

可以看到，exon inclusion level實際上是inclusion isofrom所占的比例，計算時，用長度校正了原始的reads數(shù)。其他類型的可變剪切事件也可以劃分成上述兩種isoform, 示意圖如下

可以看到，rmats在計算isofrom的長度時，提供了兩種方式，二者的區(qū)別就在于是否考慮跳過的exon的長度，詳細(xì)的公式在上圖中共也有給出。

2. 差異分析

rmats 在差異分析時，比較的就是兩組樣本中inclusion level的差異，給定閾值c,  判斷兩個樣本中對應(yīng)inclusion level 的是否發(fā)生了變化，公式如下

c這個閾值通過--cstat參數(shù)自定義，取值范圍為0-1，代表的是兩個樣本中inclusion level的差值，0.1表示兩個樣本中該可變剪切事件的inclusion level相差10%。當(dāng)然，實際計算過程是非常繁瑣的，需要考慮數(shù)據(jù)的分布，對應(yīng)的統(tǒng)計模型等各種因素，最終會給出每個可變剪切事件的p值和多重假設(shè)檢驗校正后的FDR值。

在輸出目錄下，有很多的文件，我們重點關(guān)注其中兩種文件即可。

1. AS_Event.MATS.JC.txt

2. AS_Event.MATS.JCEC.txt

這里的AS_Event對應(yīng)五種不同類型的可變剪切事件，每種類型是一個單獨的文件，而JC和JCEC對應(yīng)的是isoform effective length的兩種計算方式。由于兩種計算方式?jīng)]有絕對的孰優(yōu)孰劣的區(qū)分，所以同時給出兩種結(jié)果，在這些文件中，包含了定量和差異的結(jié)果

IJC表示inclusion isoform counts, SJC表示是skipping isoform counts, 生物學(xué)重復(fù)樣本用逗號分隔；IncFormLen代表effective inclusion isoform length, SkipFormLen代表effective inclusion isoform length；lencLevel代表定量的結(jié)果，InclevelDifference就是兩組樣本中表達(dá)量的差值，通過Pvalue和FDR可以對結(jié)果進(jìn)行過濾和篩選。

除了定量和差異的結(jié)果，還給出了每種可變剪切事件對應(yīng)的exon的區(qū)間信息，示意如下

以上示例是外顯子跳躍中的區(qū)間信息，其他類型的表頭會有一定差異，但是意思是一樣的。

rmats中，識別可變剪切是以exon為單位的，只需要比較鄰近的3到4個exon的表達(dá)情況，就可以確定一個可變剪切事件是否發(fā)生，這個思路從可變剪切最核心的地方，即exon的變化出發(fā)進(jìn)行分析，直接有效，但是由于其對問題的高度抽象和簡化，導(dǎo)致對應(yīng)的結(jié)果看起來不夠直觀。

以上就是怎么使用rmats進(jìn)行可變剪切的分析，小編相信有部分知識點可能是我們?nèi)粘９ぷ鲿姷交蛴玫降?。希望你能通過這篇文章學(xué)到更多知識。更多詳情敬請關(guān)注億速云行業(yè)資訊頻道。